Neuroproteomics (PD Dr. Stühler)

 

Neben  der Bearbeitung neurologischer Fragestellungen beschäftigt sich die aus der NRW-Nachwuchsgruppe Neuroproteomics hervorgegangene Arbeitsgruppe Neuroproteomics mit dem Schwerpunkt Biomarker-Identifizierung mittels der zell- und gewebebasierte Proteomanalyse.

Während der vom NRW-Ministerium für Wissenschaft, Innovation, Forschung und Techologie geförderten Periode ist es der Arbeitsgruppe unter Leitung von PD Dr. Kai Stühler gelungen, eine hoch-sensitive Methode zur proteomanalytischen Untersuchung von 1.000 Zellen aus der Mikrodissektion zu etablieren (Sitek et al., 2005). Diese Arbeit konnte auf verschiedenen nationalen und internationalen Kongressen als Durchbruch für die Identifizierung von Biomarkern direkt im humanen Material vorgestellt werden. Mit dieser der zell- und gewebebasierte Proteomanalyse ist es möglich neben Markerproteinen für die Immunohistochemie (Grzendowski et al., 2009, Poschmann et al., 2009) als auch Serum-Biomarker für die in vitro Diagnostik (Mölleken/Sitek et al., 2009) zu identifizieren.

 

Zell- und gewebebasierte Proteomanalyse

Proteine als biologisch funktionelle Spezies erlauben es, einen Funktionszusammenhang zu den jeweiligen Erkrankungen herzustellen und sind daher in der Lage, die Spezifität bei der Diagnose zu erhöhen. Ein Beispiel in diesem Zusammenhang ist der Nachweis von Her-2/neu im Serum von Brustkrebs-Patienten und dessen Zulassung als Krebsbiomarker durch die FDA. Her-2/neu ist seit langem als ein onkogenes Protein bekannt, das direkt bei der Entstehung von Krebs beteiligt ist und somit krankheitsspezifisch ist (Tse et al., 2005).

Der Nachweis eines Biomarkers in Blut per in vitro Diagnostik stellt für die Durchführung und Akzeptanz eines Nachweistest einen enormen Vorteil dar. Allerdings lassen sich potentielle Biomarker mit den derzeitigen Proteomics-Techniken nur schlecht im Blut nachweisen. Nur 10 Prozent der Biomarkerkandidaten gehören zu den hochabundanten Proteinen (>1 pg/ml) (Drukier et al., 2006). Gering abundante Proteine (<1 pg/ml), die nur mit spezifischen Verfahren wie zum Beispiel ELISA detektiert werden können, sind trotz ihrer schlechten Nachweisbarkeit exzellente Biomarker (Coleman, 2000).

Eine Möglichkeit, dennoch Biomarker mittels der Proteomanalyse identifizieren zu können besteht darin, direkt die erkrankten Zellen zu analysieren. In einer Zell- bzw. Gewebeprobe ist der dynamische Bereich der Proteinkonzentrationen im Vergleich zum Plasma um 5-6 Größenordnungen geringer und erlaubt den Einsatz aktueller Proteomics-Techniken. Diese im nachweisbaren Abundanzbereich befindlichen Proteine sind ausreichend konzentriert, so dass man davon ausgehen kann, sie nach Freisetzung auch in Körperflüssigkeiten wie beispielsweise Blut detektieren zu können (Drukier et al., 2006). Demnach lassen sich die für einen globalen Ansatz konzipierten Proteomics-Techniken für die Identifizierung von Kandidatenproteinen, durch die Analyse von Zell- bzw. Gewebeproben einsetzen. Für den Nachweis im Blut oder zur Validierung dieser Biomarkerkandidaten müssen dann sensitivere und spezifischere Techniken, wie sie bei der herkömmlichen klinischen Analytik Anwendung finden, herangezogen werden.

 

Durchführung der zell- und gewebebasierte Proteomanalyse

Für die quantitative Analyse des Proteoms kommt neben der Massenspektrometrie häufig noch die zweidimensionale Gelelektrophorese (2D-GE) in Frage. Mit diesen Methoden lassen sich bis zu 10.000 Proteine auftrennen und so komplexe Proteingemische quantitativ analysieren. Die erstellten Proteinprofile verschiedener Proben können verglichen und charakteristische Differenzen detektiert werden. So lassen sich mithilfe der differentiellen Proteomanalyse Proteinprofile verschiedener Krankheitsgrade miteinander vergleichen und so Rückschlüsse auf die beteiligten pathologischen Prozesse ziehen. Eine besondere Herausforderung der Proteomik besteht derzeit in der gezielten Untersuchung von erkranktem humanem Gewebe. Häufig sind nur geringste Mengen, wie etwa aus Biopsieproben verfügbar, so dass umfangreiche quantitative Analysen schwer möglich sind. Um speziell solche Analysen durchführen zu können, wurde am Medizinischen Proteom-Center ein innovatives Verfahren entwickelt, das die Identifizierung von Biomarkern aus pathologisch relevanten Patientenproben mittels  2D-GE ermöglicht. Die Besonderheit und die Stärke der neuen Technik bestehen aus der Kombination von Mikrodissektion und der sensitiven DIGE (Fluorescence 2D Difference Gel Electrophoresis)-Sättigungstechnik.

 

 

Bei der Mikrodissektion werden nur klinisch relevante Zellpopulationen vom restlichen Gewebe isoliert. Durchschnittlich können bei diesem Verfahren nur 1000 bis 5000 Zellen gewonnen werden, was der Proteinmenge von 2 bis 10 μg entspricht. Um solche geringen Proteinmengen analysieren zu können wurde die DIGE-Technik so optimiert, dass differentielle Studien an nur 1000 Zellen pro Patient möglich sind. Die Kombination beider Techniken ermöglicht erstmalig eine Proteomanalyse an Zellpopulationen aus humanem Gewebe, die im direkten Zusammenhang mit einer Erkrankung stehen (Abbildung 1).

 

Abbildung 1. Schematische Darstellung der Biomarkerforschung von der Entdeckung bis zur Validierung.

 

Mit diesem innovativem Verfahren ist es gelungen, klinische Studien im Bereich der Leberzirrhose und Niereninsuffizienz aber auch dem Pankreas- und Lungenkrebs erfolgreich durchzuführen, so dass Biomarkerkandidaten gefunden wurden, die in Validierungsanalysen (Immunhistochemie, Western-Blots und ELISA an Serumproben) bestätigt werden konnten und derzeit durch Untersuchung größerer Patientenzahlen auf ihre Eignung als Biomarker zur Unterscheidung zwischen erkrankten und gesunden Personen getestet werden. Aufgrund der vielversprechenden Ergebnisse der Proteomstudien wurden die sich hieraus ableitbaren Ansprüche durch Patentanmeldungen geschützt. Um den Ansatz der gewebebasierten Proteomanalyse zur Identifizierung von Biomarkern konsequent weiterzuführen, wird derzeit in der AG Neuroproteomics am MPC an einem neuen Verfahren zur sensitiven Analyse von klinischem Material gearbeitet. Mit diesem MS-basierten Verfahren, der sogenannten labelfreien Proteomik, zur quantitativen Analyse von komplexen Proteinproben wird es möglich sein, Proben von größeren Patientenkollektiven vollautomatisch und hoch sensitiv zu analysieren. Durch diese komplementäre Technik werden die Screening-, Identifizierungs- und Validierungsphasen auf einer Plattform vereint und somit die Zeit bis zur Bestimmung neuer Biomarkerkandidaten erheblich verkürzt. Erste Studien haben gezeigt, dass mit dem Einsatz dieser Technik eine differentielle Analyse an extrem geringen Probenmengen (500 ng Protein; 250 Zellen) möglich ist.

 

Ansprechpartner
PD Dr. Kai Stühler

Medizinisches Proteom-Center
Ruhr-Universität Bochum, ZKF E. 142
Universitätsstraße 150
44801 Bochum

Tel: 49 234/32 27561
Fax: 49 234/32 14554

 

Übersichtsarbeiten (Reviews)

 

Bibliographie